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青海沙棘重要活性成分的制备、表征及功能作用研究
利毛才让
2012-05
摘要沙棘Hippophae rhamnoides L. (Seabuckthorn)是胡颓子科(Elaeagnaceae) 沙棘属Hippophae L.多年生乔灌植物。我国分布的沙棘占世界沙棘总面积的95%以上,青海沙棘资源面积约占全国沙棘总量的10%,同时也是世界上分布海拔最高地区的沙棘。近年来随着沙棘活性成分相关产品开发的需求量不断增加,其中一些重要活性成分如沙棘中5-羟色胺、铜/锌超氧化物歧化酶的进一步深入研究已经成为提高沙棘产品附加值和沙棘产业综合效益的瓶颈。
本论文以青海广泛分布的中国沙棘果实为原料,对其重要活性成分进行测定、制备、表征和功能研究。研究主要内容、方法和取得的成果及结论如下:
1. 以高灵敏荧光发光材料2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑-乙氧基)-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)和苯并[b]吖啶酮-5-乙基对甲苯磺酸酯(BAETS),分别对20种氨基酸和18种脂肪酸进行衍生;借助LC/MS分析手段对衍生物进行鉴定和解析,准确推断各相关类型的组成成分,以外标法测定各组分相应含量。结果发现,沙棘中游离态人体必需氨基酸占总游离氨基酸中70.42%,水解后在总氨基酸中占22.68%;沙棘油中主要游离不饱和脂肪酸占总游离脂肪酸(C10-C22)的40.54%。
2. 通过ICP/MS测定沙棘果实、茎、叶、种子、种壳和茎皮中20种无机元素的总量,结果发现沙棘果、叶中Pb含量超过2010版中国药典质控规定要求。在人工模拟体内胃酸条件下,研究各元素的提取效率,分析无机元素的初级形态,结果表明沙棘果、叶、茎、种子、种壳和茎皮中Se以悬浮态存在;Hg在1% HCl中未测得;沙棘果实中Pb酸可溶态为68.45%,悬浮态为21.55%,沙棘中超标的Pb 以不同的形态存在。通过以上研究表明各元素在沙棘中以不同形态存在且不同形态存在量的比例也不同。
3. 通过柱前衍生HPLC法,建立测定痕量5-羟色胺的方法,此方法回归方程为Y=2527X-2494,相关系数r=0.9990,检测限为10.93fmol,可准确测定样品中痕量5-羟色胺的量。同时测定了青海不同生境沙棘枝条中5-羟色胺含量和沙棘不同部位的5-羟色胺含量,此结果表明生长在干旱地的沙棘中5-羟色胺量高于生长在潮湿地沙棘中5-羟色胺量;沙棘枝条中5-羟色胺含量高于其它部位。
4. 采用超声提取法和HPD600大孔树脂法确定了沙棘枝条中5-羟色胺制备工艺:提取工艺为10%乙醇,在30℃温度下超声提取12min、料液比1:10。纯化工艺为用柱内径3cm的HPD-600树脂,流速为4BV/h、样品液浓度为2.8μg/mL,大孔树脂分离后用95%乙醇和2%的盐酸纯化,干燥,制得率为54.67%。
5. 采用超声提取法、Sephadex G-75确定了纯化沙棘中超氧化物歧化酶的制备工艺,即pH为7.8磷酸缓冲液超声提取2min,再用丙酮纯化后,冷藏挥发丙酮;上Sephadex G-75柱,得到活性为436 U/mL,蛋白浓度为6.63 mg/mL的超氧化物歧化酶。且以抑制剂敏感性实验和紫外定性试验及文献确定此为铜/锌超氧化物歧化酶。
6. 通过耦合技术,利用层析技术循环洗脱,选择性吸附、修饰沙棘中Cu/Zn-SOD ,分离单甲氧基琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-mPEG-Cu/ZnSOD),建立同步修饰、分离纯化沙棘Cu/Zn-SOD 的技术平台。修饰铜/锌超氧化物歧化酶的修饰率为89.2%,修饰效果好;分离修饰后的SS-mPEG-Cu/ZnSOD其耐热效果和抗酶解能力远远大于修饰前Cu/ZnSOD。
7. 通过沙棘中5-羟色胺部位和修饰SS-mPEG-Cu/ZnSOD的果蝇寿命实验和老年小鼠脑部B 型单胺氧化酶(MAO-B)活性、SOD 活性测定和MDA 的变化,表明沙棘中5-羟色胺部位和SS-mPEG-Cu/ZnSOD具有良好的抗衰老作用。
文献类型学位论文
条目标识符http://210.75.249.4/handle/363003/16368
专题中国科学院西北高原生物研究所
推荐引用方式
GB/T 7714
利毛才让. 青海沙棘重要活性成分的制备、表征及功能作用研究[D],2012.
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