小麦HMW-GS基因克隆及转基因沉默的HMW-GS

NWIPB OpenIR

	小麦HMW-GS基因克隆及转基因沉默的HMW-GS; Molecular cloning of the novel HMW-GS genes and inheritance of transgenic silenced HMW-GS genes in wheat
	Xiang WW(相微微)
	2009-06-02
摘要	高分子量麦谷蛋白亚基(High-molecular-weight glutenin subunits)是普通小麦(Triricum aestivum L.)胚乳中的重要贮藏蛋白。高分子量麦谷蛋白亚基的组成和含量影响小麦的加工品质。农家品种中含有丰富的亚基多态性，本试验拟从农家品种中克隆表达的和沉默的亚基基因，研究其组成、序列特征及进化关系；探讨HMW-GS基因沉默的分子机制与亚基转基因沉默后遗传规律，并为小麦育种提供丰富的种质资源。主要结果如下：（1）利用SDS-PAGE分别在小麦农家品种“2004s-47”和“红火穗”中分离和鉴定了一个HMW-GS，其迁移率大小介于1Dx2和1Ax1之间。而在有芒冰麦中只鉴定出一条过表达的亚基，与“中国春”的1Bx7的亚基的迁移率一致。用grain protein content gene 的保守引物在有芒冰麦中只扩增出2B、2A、4A、4B、6A、6B，确定有芒冰麦为四倍体小麦。（2）利用一对小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因的兼并性引物，从2004s-47、红火穗和有芒冰麦中分别扩增出了分子量为2700bp，2700bp和2000bp的片段。根据目的片段的酶切位点的差异，将2004s-47和红火穗的目的片段克隆到PMD18-T Vector 上，有芒冰麦的目的片段克隆到PGEMT-easy Vector上后，采用定向缺失亚克隆的方法获得一系列定向缺失体，选择几个带有适当大小片段的克隆，使相邻克隆嵌套200bp以上，用载体的上游引物测序，并拼接成基因全序列。（3）2004s-47和红火穗的该基因具有典型的小麦HMW-GS基因序列结构特征，即包括信号肽、N-端、C-端和中央重复区等4个部分。信号肽是21个氨基酸残基组成的短肽，N-端由89个氨基酸残基构成，其中有3个半胱氨酸残基（Cys）；C-端有42个氨基酸残基，包括一个半胱氨酸残基（Cys）；中央重复区未发现有半胱氨酸残基（Cys），表明从2004s-47和红火穗中克隆的该HMW-GS基因为x-型亚基基因。（4）经NCBI上的相关软件比对，2004s-47和红火穗的1Dx基因与节节麦(Aegilops tauschii)1Dx2.1t（AF480486）同源性最高。2004s-47的Dx亚基仅有两个氨基酸残基与1Dx2.1t有差异，且都出现在重复序列区。而红火穗虽然基因序列与1Dx2.1t的同源性最高，但由于发生了碱基的缺失，导致在中间重复区域发生了移码突变，编码的氨基酸出现了改变。后由于发生了三个碱基的缺失，正好缺失了一个氨基酸，在之后编码的氨基酸又出现很高的同源性。有芒冰麦沉默表达的亚基基因序列，与1By8（AY245797）亚基的同源性最高，推断有芒冰麦的测序基因为一个沉默表达的亚基基因，命名为1ByX，登录号为FJ959383。沉默的原因在于该基因在编码序列开始后第16-262个碱基处发生小片段缺失。导致发生移码突变，出现多个提前终止密码子，最终发生基因沉默现象，这是一种新的沉默机制。（5）采用杂交及回交的方法研究转基因小麦沉默的HMW-GS基因的遗传及表达。选用Bobwhite转百萨偃麦草Glu-1Ebx基因后所有HMW-GS沉默的小麦品系QQ5与育成品种“高原314”和“新春13号”进行正反交，再用育成品种进行回交，采用SDS-PAGE 技术检测并分析各组合亲本、F1、F2、回交BC1F1的HMW-GS 组成。结果表明，HMW-GS基因沉默表现为显性，且能稳定遗传，杂交及回交后代符合3：1和1：1的分离比，遵循孟德尔遗传方式；稳定的HMW-GS沉默株系的获得为进一步获得弱筋小麦纯系奠定了基础。
文献类型	学位论文
条目标识符	http://210.75.249.4/handle/363003/36577
专题	中国科学院西北高原生物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	相微微. 小麦HMW-GS基因克隆及转基因沉默的HMW-GS, Molecular cloning of the novel HMW-GS genes and inheritance of transgenic silenced HMW-GS genes in wheat[D],2009.