截形苜蓿液泡膜H+-PPase基因的克隆及功能研究

NWIPB OpenIR

	截形苜蓿液泡膜H+-PPase基因的克隆及功能研究; Isolation and function analysis of a vacuolar H+-PPase gene from Medicago truncatula
	Wang JW(王建武)
	2009-05-29
摘要	液泡膜焦磷酸酶（V-H+-PPase）属于除P-、F-和V-类H+-ATPases之外的第4类质子泵。V-H+-PPase水解PPi产生的自由能与H+跨膜转运相偶联，形成质子驱动力，与V-H+-ATPase一起将细胞质中的H+泵入液泡中，可以建立跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质分子进出液泡提供驱动力。已有的研究结果表明植物体内V-H+-PPase活性受盐胁迫的调节。从理论上讲，液泡膜上两个H+泵中的任何一个过量表达，都有可能提高H+的利用率，增大质子驱动力，从而使细胞质中更多的盐离子区隔到液泡中以增强植物的耐盐抗旱性。V-H+-PPase由单基因编码，而且在建立跨膜电化学梯度上与由多亚基组成的V-H+-ATPase的作用相当。在拟南芥、烟草、西红柿、水稻、玉米和棉花体内上调V-H+-PPase的表达均提高了这些植物的耐盐性。此外，过表达V-H+-PPase基因还能促进植物生长素的运输，使植物的生物量增大。由此可见，V-H+-PPase基因是一个可用于作物抗逆育种的优良基因。本实验采用EST电子克隆技术，通过RT-PCR克隆了豆科模式植物截形苜蓿(Medicago truncatula)的V-H+-PPase基因MtVP1，进行了生物信息学分析及亚细胞定位，构建了植物表达载体，然后通过根癌农杆菌介导转化了拟南芥和马铃薯，并通过对转基因植株的分子生物学检测及耐盐性实验，鉴定了截形苜蓿V-H+-PPase基因的功能，主要结果如下： 1.截形苜蓿V-H+-PPase基因MtVP1的克隆、生物信息学分析、亚细胞定位及植物表达载体的构建：克隆得到了MtVP1的cDNA序列，该序列包含1个2 298 bp的最大开放读码框。生物信息学分析表明，该基因编码765个氨基酸，其氨基酸序列与来自绿豆、拟南芥等高等植物的Ⅰ类液泡膜H+-PPase的氨基酸序列的一致性高达84%~93%，其蛋白是一个典型的膜蛋白，含有13个跨膜区，含有3个在液泡膜H+-PPase中高度保守的区域(CS1、CS2和CS3)，从结构分析结果推测MtVP1与AVP1在功能上具有相似性。亚细胞定位分析结果显示，MtVP1定位在质膜和液泡膜上。构建了pBI121-MtVP1,2表达载体，用来转化拟南芥和马铃薯。 2.拟南芥转化植株的获得：用花序浸泡法转化拟南芥，在50μg/ml卡那霉素固体MS培养基上筛选阳性苗，然后利用特异性引物进行PCR和RT-PCR鉴定，均扩增出了约1000bp的特异性片段，表明MtVP1已导入拟南芥基因组中。转基因拟南芥的表型观察实验表明，过表达MtVP1能使转基因植株根系更发达，叶片面积增大；但幼苗耐盐性实验表明，转基因株系与对照没有明显差异。 3.马铃薯转化植株的获得：选用马铃薯无菌苗的叶片作为外植体，用农杆菌进行转化，诱导分化成苗后，经PCR鉴定得到了转MtVP1马铃薯植株。耐盐性实验结果表明: 转MtVP1马铃薯植株比对照具有更强的耐盐性。本研究从豆科模式植物克隆到豆科模式植物截形苜蓿(Medicago truncatula)的V-H+-PPase基因MtVP1，并把该基因转到模式植物拟南芥中，确定了该基因具有控制植物生长素运输的功能，过表达该基因能使植物的生物量增大；然后对重要的经济作物马铃薯进行了遗传转化，不仅使转基因马铃薯的叶片面积明显增大，而且提高了转基因马铃薯植株的耐盐性。
文献类型	学位论文
条目标识符	http://210.75.249.4/handle/363003/36579
专题	中国科学院西北高原生物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	王建武. 截形苜蓿液泡膜H+-PPase基因的克隆及功能研究, Isolation and function analysis of a vacuolar H+-PPase gene from Medicago truncatula[D],2009.