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植物一氧化氮合成酶关联因子的分子生物学及生理功能研究 | |
张波 | |
2010-05 | |
摘要 | 本 研究以植物一氧化氮合成酶关联因子( nitric oxide synthase associated, NOA)为切入点,利用NOA突变体Atnoa1作为实验材料,研究了内 源一氧化氮参与并调节拟南芥盐胁迫应答反应的生理生化基础。鉴于NOA在植物 中的重要作用,我们通过电子克隆并结合RT-PCR、3’RACE技术,获得了马铃薯 一氧化氮合成酶相关因子(StNOA1)cDNA全长序列,分析了马铃薯NOA基因的序 列结构,并对该基因进行原核表达。通过农杆菌介导的方法,将StNOA1基因转入 拟南芥NOA基因突变体植株,获得了转基因纯合株系。初步验证了StNOA1基因在 植物抗盐胁迫应答过程中功能。主要结论如下: 1.内源一氧化氮减轻了盐胁迫条件下拟南芥受到的生长抑制、渗透胁迫,并 且调节拟南芥叶片抗氧化酶活性,从而减轻盐胁迫下活性氧的伤害,另外,一氧 化氮也作为一种活性氧清除剂提高了拟南芥的抗盐性。 2. 从马铃薯中首次克隆到NOA(nitric oxide synthase associated) 基因, 命名为StNOA1,已登录到GeneBank,登录号(GBANa):GU205181。 3. StNOA1包含了5’UTR(Untranslated Region )和3’UTR,其cDNA全长为 1929bp,其中的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)编码了由561个氨基酸 组成的蛋白质,预测其蛋白分子量为60 kD。 4. StNOA1与烟草(Nicotiana benthamiana),葡萄(Vitis vinifera),蓖 麻 (Ricinus communis),水稻(Oryza sativa),玉米(Zea may)以及拟南芥 (Arabidopsis thaliana)均有很高的同源性 (89.44%~63.56%)。它们之间的高 度相似性主要表现为中间部位序列的高度保守,其下游和上游的氨基酸序列中一 致性降低。 5. StNOA1的中间高度保守区域包含了一个GTPase-specific的特征结构域: KxD (the GTP specificity motif), GxxxxGKS (Walker A), DxxG (Walker B), 并且和烟草、葡萄、蓖麻、水稻、玉米以及拟南芥NOA在此区域序列完全相同。 6. 对烟草、葡萄、蓖麻、水稻、玉米以及拟南芥及马铃薯NOA的全长氨基酸 序列进行系统发生分析,结果显示马铃薯和烟草的NOA序列具有高度同源性,在 进化上明显处在同一分枝上,水稻和玉米则处在与其相近的另一分支,而拟南芥 和蓖麻则处于同一分支;葡萄则处在另一分支。7. StNOA1 原核表达的蛋白分子量和预测分子量相吻合,为60 kD。但是表 达蛋白在上清中很少,大部分以包涵体形式出现。所以用8 M 尿素溶解包涵体, 使其变性,然后透析复性,获得了可溶性目的蛋白,用300 mmol/L 咪唑成功地 对StNOA1 原核表达产物进行Ni-NTA 柱亲和层析纯化。 8. 获得了四个转StNOA1 基因的转基因纯合株系。四个转基因纯合株系中 StNOA1 的表达各不相同,其中TL9 表达最强。 9. StNOA1 在拟南芥NaCl 胁迫应答反应过程中发挥了重要作用,提高了拟 南芥的抗盐能力,表现为在NaCl 胁迫下能促进拟南芥根伸长、提高幼苗成活率、 提高脯氨酸积累、降低丙二醛含量、提高叶绿素和可溶性蛋白含量。 对StNOA1 的进一步研究有助于提高农作物抗逆反应的能力,为作物抗逆的 分子育种工作提供分子生物学基础。 |
文献类型 | 学位论文 |
条目标识符 | http://210.75.249.4/handle/363003/51950 |
专题 | 中国科学院西北高原生物研究所 |
推荐引用方式 GB/T 7714 | 张波. 植物一氧化氮合成酶关联因子的分子生物学及生理功能研究[D],2010. |
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