马蔺子化学成分的分离制备及其对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢作用的研究

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	马蔺子化学成分的分离制备及其对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢作用的研究
	吕欢欢
学位类型	博士
导师	王洪伦
	2016
学位授予单位	中国科学院大学
学位授予地点	北京
关键词	马蔺原花青素类低聚芪类高速逆流色谱 3t3-l1 脂肪细胞糖脂代谢
其他摘要	马蔺为鸢尾科鸢尾属多年生草本宿根植物，主要分布在中国、朝鲜和俄罗斯。马蔺根系发达，抗逆性和适应性极强，耐盐碱。这些特征决定了它非常适合气候干燥地区的绿化改造和水土保持。马蔺的干燥种子具有去热、祛湿、止血等功效。在中医上常被用来治疗黄疸、腹泻、吐血、白带、喉痹、痈肿等。前期关于马蔺子中化学成分的研究主要围绕马蔺子素等苯醌类成分展开的，而其他化学成分的分离很少报道。本论文以马蔺子为原料，主要对马蔺子种皮提取物中的原花青素类成分、种仁提取物中的低聚芪类成分以及种皮超临界 CO 2 萃取物（SFE Ext）中的苯醌类成分进行了分离制备。在活性筛选部分，以 3T3-L1 成熟脂肪细胞为模型，主要通过研究原花青素类和低聚芪类对 3T3-L1 脂肪细胞糖脂代谢的作用，寻找马蔺子中可能具有改善肥胖症的化合物。 1、建立了应用高速逆流色谱（HSCCC）技术从马蔺子种皮提取物中分离制备高纯度原花青素类化合物的方法。马蔺子种皮乙醇提取物乙酸乙酯萃取部位经过硅胶柱色谱分离得到两个原花青素富集部位 Fr.2 和 Fr.3。（a）对 Fr.2 样品的分离采用梯度流速的 HSCCC 方法，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.75:12.5:1:12.5，v/v/v/v）为两相溶剂系统，流动相的初始流速为 1.5 mL/min，120 min 后流速增加到 3.0 mL/min，分离温度为 30℃，检测波长为 280 nm，主机转速为 900 rmp。在240 min 内从 300 mg Fr.2 样品中分离到 58 mg 原花青素 B3、72 mg 原花青素 B1、52 mg 儿茶素和 18 mg 原花青素 B7，它们的纯度分别为 98.23%、99.05%、99.03%和 96.34%。（b）对 Fr.3 样品的分离采用双泵平衡模式和连续进样的 HSCCC 方法，以乙酸乙酯-正丁醇-水（9:1:10，v/v/v）为两相溶剂系统，两相的流速为 2.2 mL/min，分离温度为 30℃，检测波长为 280 nm，主机转速为 900 rmp。600 mg Fr.3 样品通过 6 次连续进样（100 mg/time），分离得到 57 mg prodelphinidin B3、198 mg 原花青素 B3 和 162 mg 原花青素 B1，它们的纯度分别为 97.2%、98.1%和 97.3%。 2、建立了应用 HSCCC 技术从马蔺子种仁提取物中分离制备高纯度低聚芪类化合物的方法。（a）建立了应用两步 HSCCC 法分离制备种仁醇提物（ZRCT）中低聚芪类化合物。第一步，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3:6:4.2:5.5，v/v/v/v）为两相溶剂系统，head-to-tail 洗脱模式，从 300 mg ZRCT 样品中分离制备到 58 mg vitisin A、76 mg ɛ-viniferin 和 43 mg peak II。第二步，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5:5:3:6，v/v/v/v）为两相溶剂系统，tail-to-head 洗脱模式，从 100 mg peak II中分离制备到 52 mg vitisin B 和 11 mg vitisin C。分离到的 4 个低聚芪类化合物通过 HPLC 检测纯度均在 95%以上。（b）建立了应用 HSCCC 法从种仁碱提酸沉提取物（JTSC）中分离制备低聚芪类化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（2:5:3:6，v/v/v/v）为两相溶剂系统，流动相的流速为 2.8 mL/min，分离温度为 30℃，检测波长为 280 nm，主机转速为 900 rmp。从 300 mg JTSC 样品中分离制备到 73 mg vitisin D、25 mg ampelopsin B 和 16 mg cis-vitisin A。分离到的 3 个低聚芪类化合物通过 HPLC 检测纯度均在 95%以上。 3、对马蔺子种皮 SFE Ext 和 ZRCT 中的化学成分通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及制备液相色谱等进行了分离制备。（a）通过硅胶柱色谱、制备液相色谱等对 SFE Ext 进行了化学成分的分离，一共得到了 6 个化合物，分别为 β-谷甾醇、马蔺子甲素、马蔺子乙素、马蔺子丙素、熊果酸、熊果醇等。（b）通过用硅胶柱色谱、制备液相色谱对 ZRCT 中的化学成分进行了分离制备，得到 hydroxyvitisin D、Z-6、Z-8 和 4-O-β-D-(6-O-Vanilloylglucopyranosyl) vanillic acid。 4、通过 MTT、油红 O 染色、脂质定量以及 2-NBDG 摄取等实验方法，考察源自马蔺子的两种粗提物（PA：原花青素富集部位和 ZRCT：低聚芪类富集部位）、6 个原花青素类单体化合物和 9 个低聚芪类单体化合物对 3T3-L1 前脂肪细胞增殖以及对脂肪细胞中脂质积累和葡萄糖摄取的影响，初步探讨其对 3T3-L1 脂肪细胞糖脂代谢的作用。MTT 实验结果表明，待测样品在测试浓度范围内没有表现出细胞毒性，只有化合物 R-1（vitisin A）、R-3（vitisin B）、R-2（ε-viniferin）对 3T3-L1脂肪细胞活力表现出明显的浓度依赖性抑制作用。油红 O 染色和脂质含量测定结果显示，和胰岛素单独处理组相比，PA、ZRCT 与胰岛素联用后可以降低成熟脂肪细胞中脂质的积累（P<0.01），同样处理后，原花青素类化合物 P-1（procyanidin B3）和 P-6（procyanidin B6）表现出明显的降低脂肪细胞中脂质聚集以及减少脂质含量的潜力（P<0.01），R-3 和 R-2 表现出较明显的抑制脂滴的作用（P<0.01）。2-NBDG 摄取实验结果表明，ZRCT 与胰岛素联用可增强胰岛素促进的 3T3-L1 脂肪细胞对葡萄糖的摄取（P<0.01），P-2（procyanidin B1）、P-1、P-6、P-4（procyanidin B7）与胰岛素联用处理组均可以显著增加脂肪细胞对2-NBDG 的摄取量（P<0.01），R-1、R-3、R-4（vitisin C）、J-1（vitisin D）、J-4（resveratrol）、R-2、J-2（ampelopsin B）、Z-5（hydroxyvitisin D）与胰岛素联用处理组，也可以显著增强 3T3-L1 脂肪细胞对 2-NBDG 的摄取（P<0.01），使细胞对胰岛素的敏感性增强。 5、采用实时荧光定量 PCR 法检测两种粗样、6 个原花青素类单体化合物以及9个低聚芪类单体化合物对3T3-L1脂肪细胞中参与糖脂代谢的因子SREBP-1c、PPARγ、C/EBPα、aP2、GLUT4 等 mRNA 表达的影响。实验结果表明，和胰岛素单独处理组相比，PA、ZRCT、P-1、P-5、R-1、J-1 与胰岛素联用后能够显著地增加 SREBP 1c mRNA 的表达量（P<0.01）。P-5、R-1、R-3、J-1、J-4、J-2、Z-5 对PPARγ mRNA 的下调作用具有显著统计学差异（P<0.01），而 R-4 对 PPARγ mRNA则表现出上调作用（P<0.01）。和胰岛素单独处理组相比，PA、ZRCT、P-2、P-1、P-6、P-3（catechin）、P-5（epicatechin）、R-3、R-4、J-1、J-3（cis-vitisin A）、J-4、R-2、J-2、Z-5 与胰岛素联用处理后能显著降低 C/EBPα mRNA 的表达水平（P<0.01）。6 个原花青素类化合物和 9 个低聚芪类单体化合物都具有显著降低 aP2 mRNA 的表达水平的作用（P<0.01）。与胰岛素单独处理组相比，P-2、P-1、R-1、R-4、R-2与胰岛素联用处理后对 GLUT4 mRNA 的上调作用具有显著统计学差异（P<0.01）。 6、更深入研究探讨上述化合物是如何在蛋白水平参与调节 3T3-L1 脂肪细胞的糖脂代谢。通过 western blot 法观察原花青素类和低聚芪类化合物对 PPARγ、aP2、C/EBPα、SREBP 1c、GLUT4 等蛋白表达水平以及对 AMPK 活化的影响，初步探讨其对脂肪细胞糖脂代谢的作用机制。实验结果表明，PA、ZRCT 与胰岛素联用均可以增加 AMPK 的磷酸化水平，显著降低 C/EBPα 和 PPARγ 的蛋白表达水平。原花青素类单体化合物 P-2、P-1 与胰岛素联用能显著降低 C/EBPα 和 aP2 蛋白的表达水平，提高 PPARγ 的蛋白表达水平。P-6、P-4、P-3、P-5 与胰岛素联用都能降低 PPARγ、C/EBPα 和 aP2 的蛋白表达水平。P-2、P-1、P-6、P-4、P-3 与胰岛素联用均可以增加 p-AMPK 的水平。低聚芪类化合物可不同程度降低 PPARγ、C/EBPα 和 aP2 的蛋白表达水平。R-1、R-3、R-4、J-1、J-4、R-2、J-2、Z-5 与胰岛素联用可以增加 AMPK 的磷酸化水平。Western blot 和免疫荧光的结果表明，PA、ZRCT 与胰岛素联用可增强 GLUT4 蛋白的表达，原花青素类二聚体可增强 GLUT4 蛋白的表达，低聚芪类化合物 R-1、R-3、R-4、J-1、J-4、R-2、J-2 与胰岛素联用可以增强 GLUT4 蛋白的表达。另外，受试样品对 SREBP 1c 下调作用不明显。
语种	中文
文献类型	学位论文
条目标识符	http://210.75.249.4/handle/363003/5912
专题	中国科学院西北高原生物研究所
作者单位	中国科学院西北高原生物研究所
推荐引用方式 GB/T 7714	吕欢欢. 马蔺子化学成分的分离制备及其对3T3-L1脂肪细胞糖脂代谢作用的研究[D]. 北京. 中国科学院大学,2016.

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马蔺子化学成分的分离制备及其对3T3-L（16846KB）	学位论文		开放获取	CC BY-NC-SA	请求全文